PCR (изследване) - приложение. Какво представлява PCR техниката?

PCR е тест, който се използва при диагностицирането на много заболявания. Методът PCR позволява да се покаже прякото присъствие на бактерии в организма и по-специално неговата ДНК. Използва се PCR тестване, наред с други при диагностицирането на лаймска болест. Какво представлява PCR техниката? Какво е PCR в реално време?

Съдържание:

1. PCR (тестване) - каква е PCR техниката?
2. PCR (изследване) - прилагане на метода PCR
3. PCR (изследване) - Лаймска болест
4. PCR (изследване) - резултати. Могат ли да са фалшиви положителни резултати?
5. PCR (изследване) - резултати. Могат ли да са фалшиво отрицателни

PCR (полимеразна верижна реакция) е основният метод, използван в генетичните и молекулярните лаборатории. Тя е разработена през 1983 г. от Кара Мюлис, която е удостоена с Нобелова награда през 1993 г. за нея.

Чуйте за какво става дума при PCR техниката. Това е материал от цикъла ПОСЛУШАВАНЕ НА ДОБРО. Подкасти със съвети.

За да видите това видео, моля активирайте JavaScript и помислете за надстройка до уеб браузър, който поддържа HTML5 видео

PCR (тестване) - каква е PCR техниката?

PCR тестването се състои от многократно амплифициране (обикновено в 30-40 цикъла) на специфичен ДНК фрагмент, например гени, кодиращи протеини Borrelia, с използването на полимеразния ензим.

След това се използват специални молекулни оцветители, за да направят амплифицирания ДНК фрагмент видим. PCR, поради амплифицирането на специфични ДНК фрагменти, е ултра-чувствителен метод.

При метода PCR, ДНК фрагментите се амплифицират със специфични праймерни двойки за даден регион на бактериалната ДНК. Например, целевите региони в PCR, използвани при диагностицирането на лаймска болест, са гени, кодиращи протеини, напр. 16S рДНК, recA, fla, p66, OspA.

Биологичният материал, от който може да се извърши изпитването, е:

• кръв
• част от кожата от мигриращ еритем
• гръбначно-мозъчна течност
• синовиална течност или от ставния хрущял
• урина

PCR (изследване) - прилагане на метода PCR

В допълнение към диагностиката на лаймска борелиоза, използвайки метода PCR, е възможно да се открият специфични фрагменти от ДНК на други микроорганизми или хора. Следователно методът PCR се използва и при:

• диагностика и мониторинг на вирусни инфекции: херпесвируси (херпесен вирус, херпес зостер, Epstein-Barr, цитомегаловирус), ХИВ, хепатитни вируси (HBV и HCV)
• диагностика и мониторинг на бактериални инфекции, особено на тези бактерии, които не могат да бъдат идентифицирани чрез култура, например туберкулоза
• диагностика и мониторинг на неопластични заболявания: левкемия, рак на гърдата, колоректален рак, рак на белия дроб
• диагностика на предразположение към рак: рак на гърдата и яйчниците (гени BRCA1 и BRCA2), колоректален рак (гени APC и CHEK2)
• диагностика на генетични заболявания: хемохроматоза (HFE ген), таласемия (гени HBA1 и HBA2), целиакия (гени HLA)
• тестове за бащинство, които откриват ДНК съвместимостта на детето и бащата

Прочетете също: Тестове за лаймска болест - как изглеждат и каква е цената на тестовете за лаймска болест Western Blot тест и лаймска болест. Тълкуване на резултатите от тестовете, пренасяни от кърлежи: Лаймска болест, бабезиоза, бартонелоза, TBE и други.

В момента има много модификации на метода PCR. Например при диагностицирането на лаймска борелиоза се използват главно вложени PCR и PCR в реално време. Последният е количествен метод и позволява определянето на точния брой на ДНК копия на Borrelia в тествания биологичен материал.

PCR (изследвания) и лаймска болест

Серологичните тестове са в основата на диагнозата Лаймска болест. Има обаче клинични ситуации, които могат да доведат до фалшиво отрицателни тестове:

• серологичен прозорец, т.е. началният период на инфекция, в който организмът все още не произвежда специфични IgM и IgG антитела срещу спирохети на Borrelia
• при хора с имунен дефицит, които не произвеждат достатъчно антитела
• наличието на имунни комплекси, които се състоят от антигени на Borrelia spirochetes и специфични антитела за тях и предотвратяват откриването на антитела чрез серологични методи

Ако има съмнения за симптоми на лаймска болест при пациента и резултатите от серологичните тестове са отрицателни, може да се извърши молекулярно тестване, основаващо се на метода PCR.

ДНК на Borrelia spirochetes може да бъде открита в ранния стадий на инфекцията, тъй като броят на spirochetes в телесните течности е най-голям.

При диагностицирането на лаймска борелиоза се използват предимно серологични методи като ELISA, но в някои клинични ситуации генетичните тестове, използващи метода PCR, са полезни.

Колкото по-дълго е времето от инфекцията, толкова по-малко вероятно е да се открие бактериална ДНК. Следователно, в някои случаи, преди провеждането на PCR теста, бактериите се отглеждат на специална среда в продължение на 1-2 седмици и след това се провежда тестът.

Този подход се използва в случай на съмнение за лаймска болест и събрана цереброспинална течност. В късната фаза на инфекцията е по-подходящо да се направи тест ELISA.

Методът PCR не трябва да се използва при рутинната диагностика на лаймска борелиоза поради липсата на стандартизация по отношение на появата на сортове Borrelia burgdorferi в Полша.

Въпреки това, в случай на затруднения в диагностиката (особено в ранния стадий на заболяването), резултатът от PCR теста помага в процеса на диагностика.

Положителният резултат от теста означава, че в тествания материал е установено наличието на ДНК на Borrelia burgdorferi и нейните разновидности, но това не обяснява дали в организма има активна инфекция. От друга страна, отрицателният резултат не изключва наличието на бактерии в организма.

Някои лаборатории предлагат тестове за наличие на ДНК на борелия в кърлежа. Резултатът от такова изследване обаче не е в основата на диагнозата Лаймска болест при ухапан човек.

Препоръчителна статия:

Тест ELISA - какво открива? Как да прочета резултатите? Цена на теста

PCR - резултати. Могат ли да са фалшиви положителни резултати?

PCR е ултра-чувствителен метод и в същото време много чувствителен към замърсяване. Ето защо е много важно при PCR-базирани тестове да се избере подходящ вътрешен контрол, за да се изключат фалшиви положителни резултати.

Ключът е също така правилното събиране на материал за тестване, както и опитът и надеждността на диагностика, извършващ теста.

PCR - резултати. Могат ли да са фалшиво отрицателни

Както при всеки лабораторен тест, така и при метода PCR могат да се появят фалшиво отрицателни резултати. Тук е изключително важно да се събере кръв за подходящ антикоагулант, тъй като някои от тях, като хепарин, могат да инхибират PCR реакцията.

Също така, събирането на материал след началото на антибиотичната терапия може да доведе до намаляване на ефективността на PCR реакцията и по-голяма вероятност от фалшиво отрицателни резултати.

Трябва също така да се помни, че бактериите Borrelia живеят много кратко в кръвта и телесните течности, тъй като благодарение на специални рецептори те проникват много бързо в „труднодостъпни“ места в тялото.

Следователно, за разлика от диагностиката на други микроорганизми, броят на Borrelia spirochetes в биологичния материал е малък, понякога дори на границата на откриване на метода PCR. Това също може да доведе до фалшиво отрицание.

Препоръчителна статия:

Тест за трансформация на лимфоцити (LTT)

Литература

1. Dunaj J. et al. Значението на метода PCR в диагностиката на лаймска борелиоза. Преглед Епидемиол. 2013, 67, 119 - 123.
2. Лабораторна диагностика на болести, пренасяни от кърлежи. Препоръки на работната група: Национална камара на лабораторните диагностици, Национален институт по обществено здраве-Национален институт по хигиена, Национален консултант в областта на инфекциозните болести, Катедра по инфекциозни болести и невроинфекции, Медицински университет в Белосток, Полско дружество по вирусология, Варшава 2014.
3. Ružić-Sabljić E. и Cerar T. Напредък в молекулярната диагностика на лаймска болест. Експерт Rev Mol Diagn. 2017 януари; 17 (1): 19-30.
4. Валонес М.А.А. и др. Принципи и приложения на полимеразната верижна реакция в медицинските диагностични области: преглед. Braz J Microbiol. 2009 януари-март; 40 (1): 1-11.

За автора

Karolina Karabin, доктор по медицина, молекулярен биолог, лабораторен диагностик, Cambridge Diagnostics Polska Биолог със специализация по микробиология и лабораторен диагностик с над 10 години опит в лабораторната работа. Завършил Факултета по молекулярна медицина и член на Полското общество по човешка генетика, ръководител на научноизследователски стипендии в Лабораторията по молекулярна диагностика към Катедрата по хематология, онкология и вътрешни болести на Медицинския университет във Варшава. Тя защити титлата доктор на медицинските науки в областта на медицинската биология в 1-ви медицински факултет на Медицинския университет във Варшава. Автор на много научни и научно-популярни трудове в областта на лабораторната диагностика, молекулярната биология и храненето. Ежедневно, като специалист в областта на лабораторната диагностика, той ръководи основния отдел в Cambridge Diagnostics Polska и си сътрудничи с екип от диетолози в диетичната клиника на CD. Той споделя своите практически знания по диагностика и диетична терапия на заболявания със специалисти на конференции, обучения и в списания и уебсайтове. Тя се интересува особено от влиянието на съвременния начин на живот върху молекулярните процеси в тялото.